全自動(dòng)蛋白免疫印跡處理系統(tǒng)在實(shí)驗(yàn)中可能出現(xiàn)的常見(jiàn)問(wèn)題主要包括信號(hào)弱或無(wú)信號(hào)、背景高、多帶現(xiàn)象、條帶異常等，以下是對(duì)這些問(wèn)題的詳細(xì)分析：
信號(hào)弱或無(wú)信號(hào)
一抗和二抗不匹配：二抗需和一抗宿主的物種相同，例如一抗來(lái)自鼠，二抗則應(yīng)是抗鼠抗體。
抗體濃度不足：使用高濃度抗體，并在4℃條件下延長(zhǎng)孵育時(shí)間，如過(guò)夜孵育。
封閉劑與抗體交叉反應(yīng)：使用溫和的去污劑如吐溫-20，或更換封閉劑（如脫脂奶粉、BSA、血清、明膠）。
一抗不識(shí)別待檢物種的蛋白：參照說(shuō)明書(shū)，對(duì)比免疫原序列和蛋白序列，確保抗體和目的蛋白會(huì)發(fā)生反應(yīng)，并設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照。
蛋白上樣量不足：每條泳道蛋白上樣量一般不超過(guò)20μg，使用蛋白酶抑制劑并設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照。
轉(zhuǎn)膜不充分：使用可逆染色劑檢測(cè)轉(zhuǎn)膜效果，檢查轉(zhuǎn)膜操作是否正確，如PVDF膜需預(yù)先浸在甲醇中，然后浸到轉(zhuǎn)移緩沖液中。
一抗失效：使用新鮮抗體，避免重復(fù)使用導(dǎo)致有效濃度降低。
二抗受疊氮鈉抑制：避免疊氮鈉和HRP標(biāo)記抗體一起使用。
檢測(cè)試劑盒過(guò)期或底物失活：使用新鮮的底物。
背景高
未進(jìn)行特異性封閉或封閉不充分：延長(zhǎng)封閉時(shí)間，考慮更換合適的封閉劑。
一抗或二抗?jié)舛冗^(guò)高：稀釋抗體至合適濃度，或以更高稀釋度抗體延長(zhǎng)孵育時(shí)間。
二抗與封閉劑非特異性結(jié)合或反應(yīng)：設(shè)置二抗對(duì)照（不加一抗）。
未結(jié)合蛋白質(zhì)洗滌不充分：增加洗滌次數(shù)。
膜干燥：在孵育過(guò)程中防止膜變干，每一步都要保證膜有充分的反應(yīng)液，可放入攪拌子不斷攪動(dòng)或輕輕震蕩使膜浸在溶液中。
選膜不當(dāng)：硝酸纖維素膜（NC膜）比PVDF膜背景低，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇合適的膜。
多帶現(xiàn)象
細(xì)胞傳代次數(shù)過(guò)多，蛋白表達(dá)不同：使用原始未傳代的細(xì)胞株，和現(xiàn)在的細(xì)胞株一起做平行對(duì)照實(shí)驗(yàn)。
體內(nèi)表達(dá)的蛋白樣本具有多種修飾形式：如乙酰化、甲基化、烷基化、磷酸化、糖基化等，可使用試劑使樣品去磷酸化、去糖基化來(lái)證明翻譯后的修飾。
蛋白樣本降解：在樣品緩沖液中加入足夠的蛋白酶抑制劑。
檢測(cè)到未經(jīng)報(bào)道過(guò)的新蛋白或同一蛋白家族中具有相似表位而結(jié)構(gòu)不同的蛋白：查閱其他文獻(xiàn)報(bào)道，或使用BLAST搜尋，使用說(shuō)明書(shū)推薦的細(xì)胞株或組織。
一抗?jié)舛冗^(guò)高：降低抗體濃度和/或孵育時(shí)間。
條帶異常
背景有不均勻的白色斑點(diǎn)：轉(zhuǎn)膜時(shí)膜上有氣泡或抗體在膜上分布不均，轉(zhuǎn)膜過(guò)程中應(yīng)盡量去除氣泡，抗體孵育時(shí)保持搖動(dòng)。
背景有黑色斑點(diǎn)：抗體結(jié)合了封閉劑，可過(guò)濾封閉劑。
深背景出現(xiàn)白色條帶：一抗或二抗加入過(guò)多，應(yīng)稀釋抗體的濃度。
目的條帶染色過(guò)低/過(guò)高，分離不徹底：改變凝膠比例，分子量大的蛋白用低濃度膠，分子量小的蛋白用高濃度膠。
條帶“微笑”效應(yīng)：遷移過(guò)快或電泳溫度過(guò)高改變了pH值和遷移速度，可降低遷移速度或低溫電泳（如在冷庫(kù)或冰上進(jìn)行）。
相同蛋白雜交出現(xiàn)不均勻條帶：制備凝膠時(shí)凝膠凝固太快，致使泳道中丙烯酰胺的比例不均勻，可參照凝膠的配方，在凝膠中加入適量TEMED，放置時(shí)在凝膠頂部加入適量1%SDS（水稀釋?zhuān)┮苑滥z變干。
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